摘要：在复制了实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)豚鼠的基础上，使用HE和Luxol Fast Blue染色技术，观察了其组织病理变化及中药复方温阳补肾方对其的影响。结果发现应用温阳补肾方可减轻EAE豚鼠的病理损害；海马CA-3区的锥体细胞也参与了EAE的发病过程。为温阳补肾方治疗多发硬化从形态学方面提供了科学依据。

　　中图分类号：R322.81

Histopathological Changes in the Guinea Pigs with Experimental Allergic

　　Encephalomyelitis and the Effects of Wenyangbushen Decoction on Them

Bai Limin (白丽敏), Song Faxian (宋发贤), Li Xi (李 曦), et al.

　　(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)

　　The histopathological changes in the guinea pigs with experiment al all ergic encephalomyelitis (EAE) and the effects of Wenyangbushen Decoction (WD) on them were observed by HE and Luxol Fast Blue staining methods. The results show ed that the pyramidal cells in the hippocampal CA3 area were also related to the onset of EAE, and WD could reduce the pathological lesions in the guinea pigs w ith EAE. The results have provided some morphologic evidence for the clinical us e of WD in the treatment of multiple sclerosis.

　　KEY WORDS: Multiple Sclerosis; Wenyangbushen Decoction; Experimental Aller gic Encephalomyelitis; Guinea Pig

　　多发硬化（Multiple Sclerosis，MS）是一种常见的中枢神经系统（CNS）炎性脱髓鞘疾病 ，也是神经内科的常见疑难病之一，世界各地均有发病。本病多发于青、壮年，且病程长， 反复发作，迁延多年，最终出现瘫痪、失明等严重的中枢神经系统症状，严重地威胁人类的 健康［1］。温阳补肾方是孙塑伦教授多年临床治疗MS的经验方［1］，本 实验使用实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）豚鼠，研究了温阳补肾方对实验性变态 反应性脑脊髓炎的组织病理变化，为探讨中药治疗多发硬化的作用机理提供形态学依 据。

　　1　材料和方法

　　1．1　药品与试剂

　　中药煎剂：温阳补肾方按中药常规方法煎煮，制成（2 g／mL）药液。主要成分有：仙灵脾 、肉苁蓉、熟地、首乌、知母、益母草、当归、苍术、牛膝等。中药购自北京康馨达药店（ 药品来源于同仁堂北城批发部）；髓鞘碱性蛋白（MBP）：哈尔滨医科大学免疫学教研室张 凤蕴教授惠赠，浓度3．2 g／L，从新鲜牛脑提取［4］；卡介苗（BCG）：75 mg／支 ，购自中国药品生物制品检定所。

　　1．2　EAE豚鼠模型的复制

　　将髓鞘碱性蛋白（MBP）、卡介苗（BCG）、不完全福氏佐剂（IFA）按2∶1∶3（体积比）制 成抗原；使用200～250 g雄性豚鼠（预防医学科学院流行病与微生物学研究所提供），在10 ％水合氯醛（4 mL／kg）腹腔注射麻醉下，按6．6 g／kg的量给动物两后足掌皮下多点注射 MBP免疫［2］，免疫1次。

　　1．3　动物分组及处理

　　动物共分3组，每组10只。正常组：正常豚鼠，不作任何处理；模型对照组（简称对照组） ：造模后豚鼠，每天灌胃生理盐水（每只1．5 mL），直至取材；中药防治组（简称中药组 ）：造模后豚鼠于造模当天开始，每天按每公斤体重12．48 g生药的量（按体表面积折算） 给予中药温阳补肾方煎剂灌胃，直至取材。各组豚鼠相同常规饲养，每日称重并观察发病情 况。分别于免疫注射后第14、21、28天处死取材。

　　1．4　组织病理学技术

　　10％水合氯醛腹腔注射（4 mL／kg），开胸常规经心脏左心室、升主动脉灌注无菌生理盐水200 mL（快速）， 10％中性福尔马林150～200　mL灌注； 取脑和脊髓（颈膨大段及腰膨大段）福尔马林后固定48～72　h，石蜡包埋，制成石蜡切片，片厚5　μm，部分切片进行HE染色，部分切片进行Luxol Fast Blue髓鞘染色。

　　2　结果

　　2．1　EAE豚鼠的行为变化

　　MBP免疫后的豚鼠在免疫后4～5 d开始出现体重下降（见表1），　5～22 d出现一侧或两侧后肢的瘫痪无力，身体倒向一侧，伴有精神萎靡、拒食、背部脱毛、二便失禁等症状，发病高峰在24 d左右。

表1　体重变化比较（g;n=10;±s）

　　注：两组比较P＜0．012．2　病理变化

　　组织病理学观察发现，对照组与中药组豚鼠脑和脊髓内均出现：①小血管（主要是小静脉）周围炎性细胞浸润，呈特征性的单层或多层“袖套状”（或称“血管套”）改变，病灶多发性，大小不一（见图1，图2）。②脑或脊髓软膜增厚大量炎性细胞侵润（见图3）。③有些部位以胶质细胞增生为主，形成胶质小结（见图4）。④Luxol Fast Blue髓鞘染色可见白质区内髓鞘结构完全或不完全崩解、脱失（见图5）。⑤脑内出现软化灶（见图6）。③海马CA3区的锥体细胞胞质呈嗜酸性，细胞体缩小、胞浆内尼氏体消失、核固缩、核仁消失，部分细胞脱失（见图7，图8）。

图1　28 d对照组豚鼠CNS血管周围炎性细胞浸润，

　　呈“袖套”样改变HE×250

图2　28 d中药组豚鼠CNS血管周围炎性细胞浸润，

　　呈“袖套”样改变HE×250

图3　21 d侧脑室软脊膜增厚，炎性细胞浸润HE×250

图4　14 d对照组豚鼠CNS胶质细胞增生，

　　形成胶质结节HE×156

图5　14 d对照组豚鼠脊髓侧索髓鞘脱失

　　Luxol Fast Blue×250

图6　14 d对照组豚鼠丘脑内形成的软化灶HE×250

图7　14 d对照组豚鼠海马CA3区锥体细胞HE×250

图8　14 d中药组豚鼠海马CA3区锥体细胞HE×250

　　中药组豚鼠CNS内的组织病理改变同对照组相比，病理变化的形式相同，但均有不同程度减 轻，如病灶的炎性浸润细胞数及“血管套”层数中药组明显少于对照组（见图1，图2），胶质结节少于对照组等。最为显著的是海马CA3区锥体细胞的损害程度，中药组明显轻于对照组。14 d时，对照组海马CA3区锥体细胞除胞体缩小，核固缩外，大量脱失，而中药组海马CA3区的锥体细胞大部分呈嗜酸性，只有少量细胞脱失；28 d时，对照组海马CA3区的锥体细胞大部分坏死，仅有少量恢复正常，中药组则相反（见图7，图8）。

　　3　讨论

　　EAE是用异种或异体动物CNS组织、或提纯的MBP免疫敏感动物而诱发的CNS的自身免疫性疾病。由于EAE在病理、免疫、生化和临床表现上与MS极为相似，故被国内外学者公认为是研究MS的最佳动物模型。我们在显微镜下观察到发病豚鼠CNS内呈现典型的EAE组织病理改变，发病豚鼠的临床症状、体征也与文献报道一致。但在MS或EAE时海马CA3区锥体细胞的病理改变未见报道。海马CA3区的锥体细胞是海马内部联系的关键环节，担负着学习记忆等重要功能，对缺血、伤害性刺激、衰老等较为敏感［3］。本实验结果所显示的EAE豚鼠海马CA3区锥体细胞在第14天时的病理改变，以往被大部分学者认为是局部缺血所致的特异性改变，但也有人认为此种病理改变代表了神经细胞早期坏死［4］。本实验发现：在第14天时细胞体积缩小、胞浆内尼氏体消失、核固缩、核仁消失的海马CA3区，在第28天时大量锥体细胞脱失，进一步证实了神经细胞胞体缩小、胞浆内尼氏体消失、核固缩、核仁消失等病理变化并非神经组织局部缺血的特异性改变，而为神经细胞的早期坏死。EAE时海马CA3区锥体细胞的病理变化很可能是免疫毒性反应所致，机制有待于今后进一步研究和探讨。本实验发现中药组豚鼠CNS所有组织病理改变都比对照组轻，显示了中药温阳补肾方在EAE发病过程中对神经组织的保护作用。

　　中医学中无“多发性硬化”这一病证名，根据其在病程中不同时期的不同临床表现和体征，可以归属中医学的“风痱”、“痿证”等病。其病机多为肾阳亏损、肝肾阴亏、脾胃虚弱、湿热浸淫、痰湿瘀血阻络等。孙塑伦教授根据多年临床经验并综合各家经验，制定了温阳补肾、养血通络、滋阴化浊法。主要用淫羊藿、肉苁蓉温肾壮阳；当归、熟地、何首乌、牛膝、益母草养血通络；佐以知母、苍术利湿清热。用于临床可改善症状，延长缓解期，减少复发。本实验结果为温阳补肾法治疗多发硬化提供了形态学依据。

　　清华大学、香港浸会大学、北京中医药大学“中医合作研究计划”资助课题

　　白丽敏，女，54岁，教授，医学博士生导师

参　考　文　献

　　1，孙塑伦，李秀琴.温阳补肾法在神经系统疾病治疗中的应用.吉林中医药，1987，（2）：9～11

　　2，王　琳，张凤蕴，王丽群，等.MBP的提取、鉴定及EAE模型的建立.哈尔滨医科大学学报，1998，32（1）：12～13

　　3，赖　红，吕永利，高　杰，等.老龄大鼠海马CA3区神经元的酶细胞化学改变及参茎叶皂甙的抗衰老作用.中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4（2）：211～215

　　4，黄克维，吴丽娟.临床神经病理学.北京：人民军医出版社，1999.6